第五章植物的呼吸作用（二）

    在高等植物中存在着多条呼吸代谢的生化途径，这是植物在长期进化过程中，对多变环境条件适应的体现。在缺氧条件下进行酒精发酵和乳酸发酵，在有氧条件下进行三羧酸循环和戊糖磷酸途径，还有脂肪酸氧化分解的乙醛酸循环以及乙醇酸氧化途径等(图5-2)。

    图5-2 植物体内主要呼吸代谢途径相互关系示意图

一、糖酵解
    己糖在细胞质中分解成丙酮酸的过程，称为糖酵解（glycolysis）。整个糖酵解化学过程于1940年得到阐明。为纪念在研究这一途径中有突出贡献的三位生物化学家：G.Embden,O.Meyerhof和J.K.Parnas，又把糖酵解途径称为EmbdenMeyerhofParnas途径，简称EMP途径（EMP pathway）。糖酵解普遍存在于动物、植物、微生物的细胞中。
    （一）糖酵解的化学历程
    糖酵解途径（图5-3）可分为下列几个阶段：

    图5-3糖酵解途径
      1.己糖的活化(1～9) 是糖酵解的起始阶段。己糖在己糖激酶作用下，消耗两个ATP逐步转化成果糖-1，6二磷酸(F-1，6-BP)。
    如以淀粉作为底物，首先淀粉被降解为葡萄糖。淀粉降解涉及到多种酶的催化作用，其中，除淀粉磷酸化酶(starch phosphorylase)是一种葡萄糖基转移酶外，其余都是水解酶类，如α-淀粉酶(α-amylase)、β-淀粉酶(β-amylase)、脱支酶(debranching enzyme)、麦芽糖酶(maltase)等。
    2.己糖裂解(10～11) 即F-1，6-BP在醛缩酶作用下形成甘油醛-3-磷酸和二羟丙酮磷酸，后者在异构酶(isomerase)作用下可变为甘油醛-3-磷酸。
      3.丙糖氧化(12～16) 甘油醛-3-磷酸氧化脱氢形成磷酸甘油酸，产生1个ATP和1个NADH，同时释放能量。然后，磷酸甘油酸经脱水、脱磷酸形成丙酮酸，并产生1个ATP，这一过程分步完成，有烯醇化酶和丙酮酸激酶参与反应。
    糖酵解过程中糖的氧化分解是在没有分子氧的参与下进行的，其氧化作用所需要的氧来自水分子和被氧化的糖分子。
    在糖酵解过程中，每1mol葡萄糖产生2mol丙酮酸时，净产生2molATP和2molNADH H。
    根据图5-3，糖酵解的总反应可归纳为：
    C₆H₁₂O₆ 2NAD 2ADP 2H₃PO₄→2CH₃COCOOH 2NADH 2H 2ATP （5-4）
      （二）糖酵解的生理意义
    1.糖酵解普遍存在于生物体中，是有氧呼吸和无氧呼吸途径的共同部分。
    2.糖酵解的产物丙酮酸的化学性质十分活跃，可以通过各种代谢途径，生成不同的物质（图5-4）。

    图5-4 丙酮酸在呼吸和物质转化中的作用
    3.通过糖酵解，生物体可获得生命活动所需的部分能量。对于厌氧生物来说，糖酵解是糖分解和获取能量的主要方式。
    4. 糖酵解途径中，除了由己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶等所催化的反应以外，多数反应均可逆转，这就为糖异生作用提供了基本途径。

二、发酵作用
    生物体中重要的发酵作用有酒精发酵和乳酸发酵。在酒精发酵(alcohol fermentation)过程中,糖类经过糖酵解生成丙酮酸。然后,丙酮酸先在丙酮酸脱羧酶(pyruvic acid decarboxylase)作用下脱羧生成乙醛。
    CH₃COCOOH→CO₂＋CH₃CHO (5-5)
    乙醛再在乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)的作用下，被还原为乙醇。
    CH₃CHO＋NADH＋H→CH₃CH₂OH＋NAD (5-6)
    在缺少丙酮酸脱羧酶而含有乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase)的组织里，丙酮酸便被NADH还原为乳酸，即乳酸发酵(lactate fermentation)。
    CH₃COCOOH＋NADH＋H→CH₃CHOHCOOH＋NAD (5-7)
    在无氧条件下，通过酒精发酵或乳酸发酵，实现了NAD 的再生，这就使糖酵解得以继续进行。
    无氧呼吸过程中形成乙醇或乳酸所需的NADH＋H，一般来自于糖酵解。因此，当植物进行无氧呼吸时，糖酵解过程中形成的2分子NADH＋H就会被消耗掉（图5-5），这样每分子葡萄糖在发酵时，只净生成2分子ATP，葡萄糖中的大部分能量仍保存在乳酸或乙醇分子中。可见，发酵作用能量利用效率低，有机物耗损大，依赖无氧呼吸不可能长期维持细胞的生命活动，而且发酵产物的产生和累积，对细胞原生质有毒害作用。如酒精累积过多，会破坏细胞的膜结构；若酸性的发酵产物累积量超过细胞本身的缓冲能力，也会引起细胞酸中毒。

图5-5 NAD 与NADH的周转与丙酮酸还原之间的关系

三、三羧酸循环
    糖酵解的最终产物丙酮酸，在有氧条件下进入线粒体，通过一个包括三羧酸和二羧酸的循环逐步脱羧脱氢，彻底氧化分解,这一过程称为三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCAC)。这个循环是英国生物化学家克雷布斯(H.Krebs)首先发现的，所以又名Krebs 循环(Krebs cycle)。1937年他提出了一个环式反应来解释鸽子胸肌内的丙酮酸是如何分解的，并把这一途径称为柠檬酸循环(citric acid cycle)，因为柠檬酸是其中的一个重要中间产物。TCA循环普遍存在于动物、植物、微生物细胞中，是在线粒体基质中进行的。TCA循环的起始底物乙酰CoA不仅是糖代谢的中间产物，也是脂肪酸和某些氨基酸的代谢产物。因此，TCA循环是糖、脂肪、蛋白质三大类物质的共同氧化途径。
    （一）三羧酸循环的化学历程
    TCA循环共有9步反应(图5-6)。
      1.反应(1) 丙酮酸在丙酮酸脱氢酶复合体催化下氧化脱羧生成乙酰CoA，这是连结EMP与TCAC的纽带。
    丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvic acid dehydrogenase complex)是由3种酶组成的复合体，含有6种辅助因子。这3种酶是：丙酮酸脱羧酶(pyruvic acid decarboxylase)、二氢硫辛酸乙酰基转移酶(dihydrolipoyl transacetylase)、二氢硫辛酸脱氢酶(dihydrolipoic acid dehydrogenase)。6种辅助因子。6种辅助因子分别是硫胺素焦磷酸(thiamine pyrophosphate,TPP)、辅酶A (coenzyme A)、硫辛酸(lipoic acid)、FAD(flavin adenine dinucleotide)、NAD (nicotinamide adenine dinucleotide)和Mg²。

    图 5-6 三羧酸循环的反应过程
    上述反应中从底物上脱下的氢是经FAD→FADH₂传到NAD再生成NADH＋H。
    2.反应(2) 乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化下与草酰乙酸缩合为柠檬酸，并释放CoASH，此反应为放能反应(△G°，＝-32.22kJ·mol^-1)。
    3.反应(3) 由顺乌头酸酶催化柠檬酸脱水生成顺乌头酸，然后加水生成异柠檬酸。
    4.反应(4) 在异柠檬酸脱氢酶催化下，异柠檬酸脱氢生成NADH，其中间产物草酰琥珀酸是一个不稳定的β-酮酸，与酶结合即脱羧形成α-酮戊二酸。
    5.反应(5) α酮戊二酸在α酮戊二酸脱氢酶复合体催化下形成琥珀酰辅酶A和NADH，并释放CO₂。
    α酮戊二酸脱氢酶复合体是由α酮戊二酸脱羧酶(α-ketoglutaric acid decarboxylase)、二氢硫辛酸琥珀酰基转移酶(dihydrolipoyl transsuccinylase) 及二氢硫辛酸脱氢酶所组成的，含有6种辅助因子：TPP、NAD、辅酶A、FAD、硫辛酸及Mg²。该反应不可逆。
    6.反应(6) 含有高能硫酯键的琥珀酰CoA在琥珀酸硫激酶催化下，利用硫酯键水解释放的能量，使ADP磷酸化成ATP。该反应是TCA循环中唯一的一次底物水平磷酸化，即由高能化合物水解，放出能量直接形成ATP的磷酸化作用。
    7.反应(7) 琥珀酸在琥珀酸脱氢酶催化下，脱氢氧化生成延胡索酸，脱下的氢生成FADH₂。丙二酸、戊二酸与琥珀酸的结构相似，是琥珀酸脱氢酶特异的竞争性抑制剂。
    8.反应(8) 延胡索酸经延胡索酸酶催化加水生成苹果酸。
    9.反应(9) 苹果酸在苹果酸脱氢酶的催化下氧化脱氢生成草酰乙酸和NADH。草酰乙酸又可重新接受进入循环的乙酰CoA，再次生成柠檬酸，开始新一轮TCA循环。
    TCA循环的总反应式为：CH₃COCOOH 4NAD＋FAD＋ADP＋Pi＋2H₂O₃CO₂ 4NADH＋4H＋FADH₂＋ATP(5-8)
    （二）三羧酸循环的回补机制
    TCA循环中某些中间产物是合成许多重要有机物的前体。例如草酰乙酸和α酮戊二酸分别是天冬氨酸和谷氨酸合成的碳架，延胡索酸是苯丙氨酸和酪氨酸合成的前体，琥珀酰 CoA是卟啉环合成的碳架。如果TCA循环的中间产物大量消耗于有机物的合成，就会影响TCA循环的正常运行，因此必须有其他的途径不断地补充，这称之为TCA循环的回补机制(replenishing mechanism)。主要有三条回补途径：
      1.丙酮酸的羧化丙酮酸在丙酮酸羧化酶催化下形成草酰乙酸。
    Pyr＋CO₂＋H₂O＋ATPOAA ADP Pi (5-9)
    丙酮酸羧化酶的活性平时较低，当草酰乙酸不足时，由于乙酰CoA 的累积可提高该酶活性。这是动物中最重要的回补反应。
    2.PEP的羧化作用在糖酵解中形成的PEP不转变为丙酮酸，而是在PEP羧化激酶作用下形成草酰乙酸，草酰乙酸再被还原为苹果酸，苹果酸经线粒体内膜上的二羧酸传递体与Pi进行电中性的交换，进入线粒体基质，可直接进入TCA循环；苹果酸也可在苹果酸酶的作用下脱羧形成丙酮酸，再进入TCA循环都可起到补充草酰乙酸的作用。这一回补反应存在于高等植物、酵母和细菌中，动物中不存在。
    PEP＋CO₂＋H₂O→OAA Pi (5-10)
    3.天冬氨酸的转氨作用天冬氨酸和α酮戊二酸在转氨酶作用下可形成草酰乙酸和谷氨酸：
    ASP＋α-酮戊二酸OAA Glu (5-11)
    通过以上这些回补反应，保证有适量的草酰乙酸供TCA循环的正常运转。
    （三）三羧酸循环的特点和生理意义
    1.在TCA循环中底物(含丙酮酸)脱下5对氢原子，其中4对氢在丙酮酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸氧化脱羧和苹果酸氧化时用以还原NAD，一对氢在琥珀酸氧化时用以还原FAD。生成的NADH和FADH₂，经呼吸链将H 和电子传给O₂生成H₂O,同时偶联氧化磷酸化生成ATP。此外，由琥珀酰CoA形成琥珀酸时通过底物水平磷酸化生成ATP。因而，TCA循环是生物体利用糖或其它物质氧化获得能量的有效途径。
    2.乙酰CoA与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，使两个碳原子进入循环。在两次脱羧反应中，两个碳原子以CO₂的形式离开循环，加上丙酮酸脱羧反应中释放的CO₂，这就是有氧呼吸释放CO₂的来源，当外界环境中二氧化碳浓度增高时，脱羧反应减慢，呼吸作用就减弱。TCA循环中释放的CO₂中的氧，不是直接来自空气中的氧，而是来自被氧化的底物和水中的氧。
    3.在每次循环中消耗2分子H₂O。一分子用于柠檬酸的合成，另一分子用于延胡索酸加水生成苹果酸。水的加入相当于向中间产物注入了氧原子，促进了还原性碳原子的氧化。
    4.TCA循环中并没有分子氧的直接参与，但该循环必须在有氧条件下才能进行，因为只有氧的存在，才能使NAD和FAD在线粒体中再生，否则TCA循环就会受阻。
    5.该循环既是糖、脂肪、蛋白彻底氧化分解的共同途径；又可通过代谢中间产物与其他代谢途径发生联系和相互转变。

四、戊糖磷酸途径
20世纪50年代初的研究发现EMP-TCAC途径并不是高等植物中有氧呼吸的唯一途径。实验证据是，当向植物组织匀浆中添加糖酵解抑制剂（氟化物和碘代乙酸等）时，不可能完全抑制呼吸。瓦伯格(Warburg)也发现，葡萄糖氧化为磷酸丙糖可不需经过醛缩酶的反应。此后不久，便发现了戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway,PPP)，又称己糖磷酸途径(hexose monophosphate pathway,HMP)或己糖磷酸支路（shunt）。

    图5-7 戊糖磷酸途径
    （一）戊糖磷酸途径的化学历程
    戊糖磷酸途径是指葡萄糖在细胞质内直接氧化脱羧，并以戊糖磷酸为重要中间产物的有氧呼吸途径。该途径可分为两个阶段（图5-7）。
      1.葡萄糖氧化脱羧阶段
    (1)脱氢反应 在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose6phosphate dehydrogenase)的催化下以NADP为氢受体，葡萄糖-6-磷酸(G6P)脱氢生成6-磷酸葡萄糖酸内酯(6phosphogluconolactone,6PGL)。
      (2)水解反应 在6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(lactonase)的催化下，6-PGL被水解为6-磷酸葡萄糖酸(6phosphogluconate,6-PG)。反应是可逆的。
    (3)脱氢脱羧反应 在6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase)催化下，以NADP为氢受体，6-PG氧化脱羧，生成核酮糖-5-磷酸(Ru5P)。
    本阶段的总反应是：
    G6P＋2NADP＋H₂O→Ru5P＋CO₂＋2NADPH＋2H (5-12)
      2.分子重组阶段经过一系列糖之间的转化，最终可将6个Ru5P转变为5个G6P(图5-7中反应4～12)。
    从整个戊糖磷酸途径来看，6分子的G6P经过两个阶段的运转，可以释放6分子CO₂、12分子NADPH，并再生5分子G6P。戊糖磷酸途径的总反应式可写成： 6G6P＋12NADP＋7H₂O→6CO₂＋12NADPH＋12H＋5G6P＋Pi (5-13)
    (二)戊糖磷酸途径的特点和生理意义
    1.PPP是葡萄糖直接氧化分解的生化途径，每氧化1分子葡萄糖可产生12分子的NADPH H，有较高的能量转化效率。
    2.该途径中生成的NADPH在脂肪酸、固醇等的生物合成、非光合细胞的硝酸盐、亚硝酸盐的还原以及氨的同化、丙酮酸羧化还原成苹果酸等过程中起重要作用。
    3.该途径中的一些中间产物是许多重要有机物质生物合成的原料，如Ru5P和R5P是合成核苷酸的原料。E4P和EMP中的PEP可合成莽草酸，经莽草酸途径可合成芳香族氨基酸，还可合成与植物生长、抗病性有关的生长素、木质素、绿原酸、咖啡酸等。
    4.该途径分子重组阶段形成的丙糖、丁糖、戊糖、己糖和庚糖的磷酸酯及酶类与卡尔文循环的中间产物和酶相同，因而戊糖磷酸途径和光合作用可以联系起来。
    5.PPP在许多植物中普遍存在，特别是在植物感病、受伤、干旱时，该途径可占全部呼吸的50%以上。由于该途径和EMP-TCAC途径的酶系统不同，因此当EMP-TCAC途径受阻时，PPP则可替代正常的有氧呼吸。在糖的有氧降解中，EMP-TCAC途径与PPP所占的比例，随植物的种类、器官、年龄和环境而发生变化，这也体现了植物呼吸代谢的多样性。

五、乙醛酸循环
植物细胞内脂肪酸氧化分解为乙酰CoA之后，在乙醛酸体(glyoxysome)内生成琥珀酸、乙醛酸和苹果酸；此琥珀酸可用于糖的合成，该过程称为乙醛酸循环(glyoxylic acid cycle,GAC)。动物和人类细胞中没有乙醛酸体，无法将脂肪酸转变为糖。植物和微生物有乙醛酸体。油料植物种子(花生、油菜、棉籽等)萌发时存在着能够将脂肪转化为糖的乙醛酸循环。水稻盾片中也分离出了乙醛酸循环中的两个关键酶——异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶。

    图 5-8 乙醛酸循环
    （一）乙醛酸循环的化学历程
    脂肪酸经过β-氧化分解为乙酰CoA，在柠檬酸合成酶的作用下乙酰CoA与草酰乙酸缩合为柠檬酸，再经乌头酸酶催化形成异柠檬酸。随后，异柠檬酸裂解酶(isocitratelyase)将异柠檬酸分解为琥珀酸和乙醛酸。再在苹果酸合成酶(malate synthetase)催化下，乙醛酸与乙酰CoA结合生成苹果酸。苹果酸脱氢重新形成草酰乙酸，可以再与乙酰CoA缩合为柠檬酸，于是构成一个循环（图5-8）。其总结果是由2分子乙酰CoA生成1分子琥珀酸，反应方程式如下：
    2乙酰CoA＋NAD→琥珀酸＋2CoA＋NADH＋H(5-14)
    琥珀酸由乙醛酸体转移到线粒体，在其中通过三羧酸循环的部分反应转变为延胡索酸、苹果酸，再生成草酰乙酸。然后，草酰乙酸继续进入TCA循环或者转移到细胞质，在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEP carboxykinase)催化下脱羧生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，PEP再通过糖酵解的逆转而转变为葡萄糖6磷酸并形成蔗糖。
    油料种子在发芽过程中，细胞中出现许多乙醛酸体，贮藏脂肪首先水解为甘油和脂肪酸，然后脂肪酸在乙醛酸体内氧化分解为乙酰CoA，并通过乙醛酸循环转化为糖，直到种子中贮藏的脂肪耗尽为止，乙醛酸循环活性便随之消失。淀粉种子萌发时不发生乙醛酸循环。可见，乙醛酸循环是富含脂肪的油料种子所特有的一种呼吸代谢途径。
    以后在研究蓖麻种子萌发时脂肪→糖类的转化过程中，对上述乙醛酸循环途径作了修改。一是乙醛酸与乙酰CoA结合所形成的苹果酸不发生脱氢，而是直接进入细胞质逆着糖酵解途径转变为蔗糖。二是在乙醛酸体和线粒体之间有“苹果酸穿梭”发生(图5-9)。

    图5-9 修改后的脂肪酸通过乙醛酸循环转化为蔗糖的途径
    由图5-9可以看出，通过“苹果酸穿梭”和转氨基反应解决了乙醛酸体内NAD的再生和OAA的不断补充，这对保证GAC的正常运转是至关重要的。
    （二）乙醛酸循环的特点和生理意义
    1.乙醛酸循环和三羧酸循环中存在着某些相同的酶类和中间产物。但是，它们是两条不同的代谢途径。乙醛酸循环是在乙醛酸体中进行的，是与脂肪转化为糖密切相关的反应过程。而三羧酸循环是在线粒体中完成的，是与糖的彻底氧化脱羧密切相关的反应过程。
    2.油料植物种子发芽时把脂肪转化为碳水化合物是通过乙醛酸循环来实现的。这个过程依赖于线粒体、乙醛酸体及细胞质的协同作用。

六、乙醇酸氧化途径

    图5-10 水稻根中乙醇酸途径
    乙醇酸氧化途径(glycolic acid oxidation pathway)是发生在水稻根系中的一种糖降解途径(图5-10)。水稻根呼吸产生的部分乙酰CoA不进入TCA循环，而是形成乙酸，然后乙酸在乙醇酸氧化酶及其它酶类催化下依次形成乙醇酸、乙醛酸、草酸和甲酸及CO₂，并且不断地形成H₂O₂。H₂O₂在过氧化氢酶催化下产生具有强氧化能力的新生态氧，并释放于根的周围，形成一层氧化圈，使水稻根系周围保持较高的氧化状态，以氧化各种还原性物质(如H₂S、Fe² 等),抑制土壤中还原性物质对水稻根的毒害，从而保证根系旺盛的生理机能，使稻株正常生长。

附加题目