第3节 核酸的结构
一、DNA双螺旋模型的提出
依据
n a.1938. W. T. Astbury 首次用X－射线分析DNA
n b.1950 Chargaff A G / T C = 1
A T ≠ G C
n c.1952 Alexander Todd
发现了核苷酸和核苷酸之间由磷酸二酯键联接
n d.1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin
得到了高度定向的DNA纤维的X-射线照片
发现原子长轴存在0.34和3.4nm两种周期性
n 此外，之前的密度测定表明螺旋由两条多核苷酸链组成，且直径恒定（2nm)。
Watson-Crick的DNA双螺旋
n 两条相互独立的单链DNA分子以螺旋方式相互缠绕，形成右手双螺旋；
n 带有负电的戊糖-磷酸骨架在分子的外侧；
n 碱基则平面堆积于螺旋的内部；
n 由于骨架双链在螺旋轴上的间距不相等，从而在分子表面形成大沟和小沟。
双螺旋模型参数
n 直径20Å
n 螺距为34Å (任一条链绕轴一周所升降的距离)
n 每圈有10个核苷酸(碱基)
n 两个碱基之间的垂直距离是3.4Å。螺旋转角是36度。
n 有大沟和小沟，配对碱基并不充满双螺旋空间，且碱基对占据的空间不对称。
二、影响双螺旋结构稳定性的因素
范德华力（Van de waals force）
疏水作用力 (Hydrophobic interaction)
* 不稳定因素
n 磷酸基团间的静电斥力
n 碱基内能增加(温度), 使氢键因碱基排列有序状态的破坏而减弱
三、双螺旋结构的基本形式
图
B-DNA：资料来自相对湿度为92％所得到的DNA钠盐纤维。
此外人们还发现了A、C、D、E等右手双螺旋和左手双螺旋Z构象等形式。
DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同一种双螺旋结构内参数存在差异的现象。
原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键，磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键。
四、一些DNA序列的不寻常结构
1、反向重复序列与二级结构
n 反向重复序列（inverted repeatitive sequence or inverted repeats, IR）,又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同时存在于一个分子中，但具有相反的方向。有时也有不完全相同的情况。
¨RNA和DNA中都可能存在
n 此外还可有directed repeatitive sequence ---正向重复序列
n 较短的回文序列可能是作为一种信号
n 如：限制性内切酶的识别位点
n 一些调控蛋白的识别位点
n 例如限制性内切酶 EcoRⅠ的识别位点
5‘－－GAATTC－－3’
3‘－－CTTAAG－－5’
2. 三螺旋DNA (Trible Helix DNA, T.S DNA)
（1）发现和证实
1953年，Watson & Crick D.S DNA model证明沿大沟存在多余
的氢键给体与受体
潜在的专一与DNA (蛋白质) 结合的能力
形成T.S DNA 可能性
1957 年Felsenfeld等发现一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核苷酸双链能够形成三链
如： polyA/polyU polydA/polydT polyd (AG)/polyd(CT)
——三螺旋DNA的概念提出
1987年Mirkin . S . M证明plasmid DNA在 pH= 4.3的溶液中, 有T.S DNA的存在，
这些发现促进了三螺旋DNA的研究
（2）组成形式
a、D.S. DNA D.S.DNA→T.S. DNA S.S. DNA
b、 分子组成
☆ PY/PU PU (偏碱性介质中稳定) G＊G 、 A＊A 、G＊C＋
☆ PY/PU PY (偏酸性介质中稳定) 常见类型 G＊C＋ A＊T
3、四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA
结构特点：基本结构单元－－鸟嘌呤四联体
可能的功能：
A、 稳定真核生物染色体结构
B、 保证DNA末端准确复制
C、 与DNA分子的组装有关
D、 与染色体的 meiosis & mitosis 有关
第四节 核酸的物理化学性质
DNA双股链的互补是其结构和功能上的一个基本特征， 也是DNA研究中一些实验技术的基础
1、条件：加热，极端pH，有机溶剂（ 尿素、 酰胺 )，低盐浓度等
2、变性过程的表现
¤ 是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很窄的温度范围
¤ 导致一些理化性质发生剧烈变化
3、熔解曲线与Tm值
缓慢而均匀地增加DNA 溶液的温度（现可做到 0.1 ℃／分）可根据各点的A260值绘制成DNA的熔解曲线 。
Tm=℃ of Ct = C0/2 = OD增加值的中点温度(一般为85-95℃) 或DNA双螺旋结构失去一半时的温度
这也是一般PCR实验技术中把变性温度定为94 ℃的原因。
4、影响 Tm值的因素
（1） 在 A, T, C, G 随机分布的情况下 ，决定于GC含量
n GC%愈高 → Tm值愈大
n GC%愈低 → Tm 值愈小
（2）GC%含量相同的情况下
AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小。
碱基排列对Tm值具有明显影响
]生物体内仅UAA为最有效的终止密码子
n 因为：UAA、AUU的Tm值是最低的一个，即使生理温度下也不稳定。
二、DNA分子的复性
（anneal or renaturation）
n 概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以 重新地合成双螺旋结构的过程（退火）。
根据复性动力学公式我们可以知道什么？
(1) 单链浓度随着时间的增大而减小；
(2) 反应速率取决于初始的单链浓度Co；
(3) 以反应浓度和COt1/2为座标可绘复性曲线;
(4) 通过COt1/2值可测原核生物基因组的大小;
已知大肠杆菌的基因组为4.2x106bp, COt1/2 = 9M.Sec 则
(5)原核生物基因组大小不同，复性曲线也不同;
(6) 可用以区分真核生物和原核生物基因组。
在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢？可以通过哪些法来检测？
(1) 减色效应（hpochromic effcef）
测定光密度，即OD值(optical density），DNA从单链变成双链，OD260减少30%
(2) 羟基磷灰石柱层析
羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢，不易吸附单链。
四、核酸分子杂交（hybridization）
※ 杂交形式：
n 液相杂交
n 固相杂交(滤膜杂交)
¨1975 E. M. Southern
¨Southern blot S.S. DNA × S.S. DNA
¨1977. J.C. Alwine
¨Northern blot S.S. RNA × S.S. DNA
¨1978. Hany Towbin
¨Western blot Protein (antigen ) × antibody
＊固相分子杂交(1975 E. M. Southern)
第5节 超螺旋和拓扑异构
一、超螺旋(superhelix OR supercoil)的形成和类型
l形成
松驰态DNA （relax form）
低能量 常态
超螺旋（Supercoied） DNA
正超螺旋 负超螺旋
DNA的超螺旋结构
正超螺旋（positive supercoiled ） 紧缠overwinding (右旋)
负超螺旋（Negative Supercoiled ） 松缠unwinding (左旋)
原核生物DNA的三级结构：
n 绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。
二、超螺旋的定量描述
n White方程： L=T W
n 连接数L（Linking nnmber）：指cccDNA中一条链绕另一条链的总次数。其特点是
(1) L是整数；
(2) 在cccDNA的任何拓扑学状态中其值保持不变；
(3) 右手螺旋对L取正值。
n T（Twisting number）：盘绕数，即DNA分子中Watson-Crick螺旋数，初级螺旋圈数。其特点是：
(1) 可以是非整数；
(2) 是变量；
(3) 右手螺旋时T为正值。
n W（Writhing number）：超盘绕数，即超螺旋数，直观上为双螺旋在空间的转动数。其特点是：
(1)可以是非整数；
(2)是变量；
(3)右手螺旋时，W取负值。
本节课内容回顾:
1、碱基、核苷、核苷酸的化学组成
2、核酸的一级结构 书写方向
3、Watson ＆ Crick 的Double Helix Model
参数 大小沟 二级结构的多态性
4、影响二级结构的作用力：
稳定因素 不稳定因素
5、DNA的不寻常结构：
反向重复序列 三螺旋DNA 四链DNA
6、变性：溶解曲线 Tm 影响因素（GC、
化学试剂、 盐、pH）
7、复性 C0t曲线 C0t（1／2）
8、核酸分子杂交的类型
9、DNA的超螺旋结构 形成、类型
