五、DNA的复制（DNA replication）
绝大多数DNA的复制是在细胞分裂间期的S期中进行。复制的简要过程是：① DNA双链分子的碱基对间的氢键逐步脱开，两条多核苷酸链彼此逐渐分开；② 双链一面分开，一面以每一条单链为模板各自将对应的核苷酸聚合起来；③ 新核苷酸链与原有的多核苷酸链形成新的双螺旋。这样，在DNA聚合酶和其他多种酶的作用下，一个DNA分子就复制为两个结构上完全相同的DNA分子（图3-10）。
亲代DNA分子(1)的螺旋打开，每一条链作为新链合成的模板(2),最后形成两条相同的 新DNA分子(3)
1．DNA复制是半保留方式
DNA复制所产生的两条新DNA分子与原来的DNA分子完全相同。由于每条子代DNA分子的两条核苷酸链中，一条来自亲DNA分子，另一条是新合成的，所以这种复制方式称为半保留复制（semi-conservative replication）。
关于半保留复制方式的机理最初是Watson和Crick（1953）根据实验提出的模型。在1958年Meselson 和Stahl用实验证实了这一设想。他们采用了氯化绝离心实验（图3-11）。
把大肠杆菌在含15N的NH4Cl的培养基中培养15代，使所有的细菌DNA都被15N标记，然后把细菌迅速转移至含14N的NH4Cl的培养基中培养，在不同间隔时间取出样品，将细胞裂解，把裂解液放在CsCl密度梯度中离心（60000转/分，48小时）。由于在超速离心时，Cl– 和Cs 被强大的离心力抛向离心管底部，但离子扩散力又使这些离子上浮，2种相反力达到平衡时，在离心管中形成CsCl分布梯度，从离心管顶端往下浓度逐渐递增，越向下密度越大。不同的DNA分子将按照各自的密度停留在相应的密度的某一位置上，形成一条带。在正常情况下，可以在紫外光下观察到不同密度的DNA分子不同位置上形成区带。
当把所有的细菌分别进行离心后发现，经15N标记的DNA在离心管下层形成一条带（下层带）；经在14N中培养一代的DNA，由于含有一重链（15N）和一轻链（14N），结果有有一条带，位于15N和14N的带之间（中间带）；而在14N中生长两代的DNA，又经过了一次复制，形成一条l4N/15N 杂种分子（中间带）和一个14N/14N的轻分子（上层带），即在离心管中形成2 条带：一条带位于14N和15N中间，另一条同14N带相一致。这样就证明了DNA复制是半保留的，并有力地否定了DNA的全保留和不保留等复制方式。
2．DNA复制的方向是按5′ →3′ 进行的
复制过程中，新加入的脱氧核苷三磷酸（dNTP）总是以它的5′位磷酸与DNA链上3′端的–OH-缩合脱去焦磷酸，形成了3′ 磷酸酯键。也就是说，DNA新链的延伸生长总是在3′端。那么复制方向总是5′→3′。
3．DNA复制所需的各种酶
DNA复制是一个非常复杂的酶促过程，它需要30多种酶和蛋白质共同作用。人们常把这些酶和蛋白质称为复制体系，其中一部分酶和蛋白质结合在一起，协同动作，构成复杂的复制体系——复制体（replisome）。
（1）DNA聚合酶（DNA polymerase）
DNA聚合酶在不同的生物中其结构、功能各不相同（表3-5）。
表 3-5 3种大肠杆菌DNA聚合酶的性质比较。
性 质 聚合酶Ⅰ 聚合酶Ⅱ 聚合酶Ⅲ
3′→5′外切校正
5′→3′外切校正 — —
新生链的合成或聚合 — —
相对分子质量/103 103 90 900
细胞内分子数 400 ？ 10~20
生物学活性 1 0.05 15
已知的结构基因 polA pol B polC（dnaE、N、Z、X、Q等）
在真核细胞中主要有5种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε，其特性如表3-6。真核细胞的DNA聚合酶和细菌DNA聚合酶基本性质相同，均以dNTP为底物，需Mg2 激活，聚合时必须有模板链和具有3′-OH末端的引物链，链的延伸方向为5′→3′。但真核细胞的DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活性，推测一定有另外的酶在DNA复制中起校对作用。真核生物中的DNA聚合酶α的功能主要是引物合成；β活性水平稳定，可能主要在DNA损伤的修复中起作用；δ主要负责DNA复制的酶，参与前导链和后随链的合成；ε的主要功能可能是去掉RNA引物后把缺口补全。
表 3-6 真核生物DNA聚合酶的特性比较
性 质 聚合酶α 聚合酶β 聚合酶γ 聚合酶δ 聚合酶ε
3′→5′外切校正 无 无 有 有 有
5′→3′外切校正 无 无 无 无 无
功 能 DNA引物合成 损伤修复 mtDNA复制 核DNA复制 核DNA复制
在细胞内分布 核内 核内 线粒体 核内 核内（?）
亚基数 4 1 2 2~3 ≥1
（2）DNA连接酶
DNA聚合酶虽能充填缺口，甚至聚合了很长的DNA互补链，但都无法使缺口接合，只有DNA连接酶可以完成这一任务。在当缺口的3′-OH和5′-P相邻并且各自的碱基处于配对状态时，DNA连接酶才能起作用（图3-12）。由于连接反应是在3′-OH和5′-P之间进行。因此必须水解ATP或NAD供应能量，真核生物中连接酶使用ATP，E.coli使用NAD。
（3）螺旋酶（helicases）或解旋酶
是促进DNA的两条互补链分离的一类酶，细胞中含有多种螺旋酶。它们的功能相互重迭或平行。这大概是由于许多反应都需要DNA螺旋的分离，特别是DNA复制这个精确度要求特高的反应更是如此。绝大多数螺旋酶在解链过程中都需要水解ATP供应能量，它们具有依赖于DNA的ATPase活性。
螺旋酶可以分为两类：一类是反应后酶分子按化学计量方式与产物单链DNA结合，如螺旋酶Ⅰ螺旋酶Ⅱ，另一类是仅仅催化DNA双链的分离，它们常与单链DNA结合蛋白（简称SSB 蛋白）配合，以防止链间或链内“退火”。如E.coli的rep蛋白，螺旋酶Ⅲ，T4的基因4蛋白等。人们相信，在E. coli中rep蛋白是最主要的螺旋酶，它解开一个碱基对，需要水解2个ATP分子。
（4）DNA旋转酶
是大肠杆菌中重要的拓扑异构酶，大多数天然DNA都具有负超螺旋，它不但可以变为泡状单链形式，有利于许多蛋白质的结合，而且在复制的开始阶段，可以缓解由于复制叉的移动而造成的超缠现象。
DNA旋转酶有4个亚基，两个α-亚基和两个β-亚基。DNA断裂后，两个5′-P末端共价连接于两个α-亚基。这样，断裂双链DNA两端连接于同一个酶分子上，而不致于造成开 环；另一方面，它储藏了磷酸二酯键断裂所释放出来的能量。在转变符号后重新连接时不再 需要活化。然而，这一过程仍要消耗ATP。
（5）单链结合蛋白（SSB蛋白，single strand binding protein）
这是四聚体结构，单体有177个氨基酸，每个真核细胞中有800多个拷贝。其作用主要是：参与DNA复制引发体的组装；消除使pol Ⅲ停止前进的二级结构；促进大肠杆菌polⅡ、polⅢ的活性；能提高DNA复制的忠实性。避免单链退火或形成链内氢键，单链区必须与SSB蛋白结合。
（6）RNA聚合酶
主要是在DNA复制时，先由它产生一段RNA引物。进而才在DAN聚合酶的作用下合成DNA，真正进行DNA复制。
4．复制的半不连续性
DNA复制时，在解旋酶的作用下，双链解开，每条单链都作为模板，合成新链。这时，一条新链可以按5′→3′方向进行连续复制。但另条链的合成不能按3′→5′进行，必然仍按5′→3′方向进行。
1968年，日本的遗传学家冈崎（Okazaki）利用3H胸腺嘧啶标记大肠杆菌，发现这条链的合成是不连续的。实际上，随着复制叉的延伸，双链DNA分段逐渐解开，其中一条链连续复制，另一条链也按5′→3′方向合成新链片段，即冈崎片段（Okazaki fragment），然后这些片段 再由连接酶接成一完整的单链（图3-13）。那么，紧随复制叉进行复制的一条单链称为前导链（leading strand），另一条先合成冈崎片段，再连接成的单链称为后随链或延迟链（lagging strand）。
实验证明，在原核生物中（主要是细菌），每一冈崎片段约有1000~2000个核苷酸；在真核生物中，每一冈崎片段约长100~200个核苷酸。
5．DNA复制时需有RNA做引物
已知的DNA聚合酶都不能在复制时直接起始DNA新链或冈崎片段的合成，只能在已有引物的3′-OH上聚合核苷酸，延伸DNA链。因此，在合成冈崎片段时，必须先借助RNA聚合酶，以 DNA为模板，合成一小段RNA（约含几十个核苷酸），叫做“引物RNA”。然后DNA聚合酶再合成DNA片段。当整条链合成完毕或冈崎片段相连后，DNA聚合酶I 再把RNA引物去掉，替换上相应的DNA片段，最后由DNA连接酶把片段完整地连接起来。
6．DNA复制时具有特定的起始点和终止点
（1）复制起点：经过电镜和其他方法证实，原核生物的DNA复制都只有一个起点，而且是双向进行的。这个复制起点（origin of replication）通常用ori或O表示。利用分子克隆的方法了解到，许多细菌的ori 区域的碱基顺序都十分保守，这段顺序约含有200多个碱基对，经常出现回文对称结构，即反向重复顺序（inverted repeats，IR），所以易与复制有关的蛋白质所识别。真核生物的DNA复制也是从特定的区域开始，向2个方向等速进行的。与原核生物不同的是复制起点不是一个而是多个，甚至达上千个。
（2）复制子：复制从起点开始，双向进行，直到终点为止（图3-14）。在DNA复制时，每个这样的DNA复制单位称为复制单元或复制子（rep1icon），这些复制子并不是同时开始复制，它们的激活各有不同的特定时刻。高等生物染色体上有数百至数万个复制子。如果蝇DNA中约有3500个复制子，在酵母中约有500个。而大肠杆菌的DNA只有一个复制子。
（3）终止子：从DNA复制起点开始，经过延伸，到达终止点，完成一个复制子的复制。这个使复制结束的区域称为终止子（terminator）。但也有例外的情况，如在枯草杆菌中，复制从特定位点开始，但复制叉移动不对称，一个方向只移动1/5DNA，另一个方向移动4/5 DNA，最后相遇。
7．DNA复制的高度准确性
在大肠杆菌中，每复制105个核苷酸可能出现一个误差，在真核生物中，DNA复制出错率在3×109bp的基因中仅有3个碱基发生错误。这种复制的准确性除了由互补碱基配对的严格性外，还有DNA聚合酶的校正功能。在原核生物中，某些DNA 聚合酶具有校正功能，如大肠杆菌的DNA聚合酶I除了起聚合作用外，还具有3′→5′的外切酶活力，它能识别错配的碱基，切去错误的核苷酸，并安放正确的核苷酸。真核生物的DNA聚合酶无校正功能，但另有其他机制来保证复制的准确性。校正机制主要有以下几种：
（1）在复制中的校正：由DNA聚合酶的3′→5′ 校正外切酶来进行。如果在引物链3′-OH末端是错配的核苷酸，则不能作为有效的模板而继续延长。这时，DNA聚合酶的3′→5′校正外切酶把错配的核苷酸切掉。直到产生一个配对正确并具有3′-OH末端的引物链；然后才以5′→3′的合成活性使链继续延长。因此，DNA聚合酶是种自我校正酶，在它沿着DNA模板前进中随时去掉自己在聚合反应中所发生的错误。
（2）复制后的二次校正：当经过第一次DNA聚合酶的3′→5′外切酶的校正后，为了消除在复制了的新链中仍可能有的少量错误，将进行第二次校正。这二次校阅系统所识别的不是错配的具体的核苷酸，而是由于错配而造成的螺旋外部的扭曲。当识别出某扭曲位点后，必须准确地把新链中的错配核苷酸消除与校正（图3-15）。如果把作为复制模板的旧链中正确的核苷酸去掉，就会以错配链为模板而把错误固定下来，因而产生变异。
(a) 模板链和新生链上不配对碱基及GATC序列的甲基化状况; (b) 错配矫正酶结合于未甲基化的GATC及同一条链上的错配碱基; (c) 错配矫正酶切除一段包含错配碱基的DNA; (d)聚合酶进行缺口充填
8．DNA复制类型的多样性
根据DNA合成的起始方式，复制可分为多种类型。
（1）复制叉式或θ复制：DNA在复制原点解开成单链状态，分别作为模板，各自合成其互补链，则出现两个叉子状的生长点，叫做复制叉。具有双链环状DNA的细菌和病毒的DNA复制形状象希腊字母θ，因而称为θ复制，又叫Cairns复制（是由Cairns首先发现的），其复制子称为Cairns分子。在θ复制中同样有双向复制和单向复制（图3-16），大多数生物为双向等速复制，也有少数双向不等速复制的情况。
（2）滚环式复制（rolling circ1e replication）或σ式复制：这种复制方式比较广泛，在噬菌体、病毒、线粒体和叶绿体DNA、细菌质粒、两栖类卵母细胞核糖体基因扩增等都有该类DNA复制方式。
现以φX174噬菌体为例说明滚环式复制过程。φX174噬菌体的遗传物质是环形正链单链DNA，它可自身复制或转录，产生RNA，翻译成蛋白质等。当DNA进入宿主细胞后，先合成一条互补的负链，与正链配成双螺旋，从而形成了环状的双链DNA。称为复制型（RF）。复制开始时双链DNA中的正链被一种限制性内切酶切开一个缺口，暴露出了3′末端和5′末端。5′末端可能固定在细胞的某种结构上，同时DNA环进行滚动（图3-17）。随着滚动，在DNA聚合酶的作用下，3′末端不断添上核苷酸而延长，为前导链；5′末端则连续延伸成一条尾巴。随后，以5′ 端尾巴为模板合成了互补DNA链，从而使尾巴变成了DNA双螺旋，合成的互补链为后随链。后随链亦按不连续合成方式先合成冈崎片段，然后连接成整链。由于环形DNA多次循环滚动，这条双链尾巴可延伸达噬菌体DNA长度的6~10倍。尾巴被内切酶依环状DNA长度分割成若干段。每段的两条链均具有彼此形成互补关系的5′末端，称为粘性末端。粘性末端配对，形成环形双链DNA。然后，在连接酶作用下，封闭缺口，形成完整的双螺旋DNA环。
与其他复制方式相比，滚环式复制是一种快速的DNA复制方式。
（3）D环式复制（D-loop replication）：在线粒体和叶绿体DNA中除发现滚环式复制外，1977年 Jerome Vinograd 等人还发现了 D环式复制。双螺旋的两条模板链并不同时进行复制，轻链（含嘧啶碱基较多的链）先开始复制，稍后重链再开始复制。当复制沿轻链开始时，重链上产生了“D”形环（图3-18）。随着环形轻链复制的进行，D环逐渐增大，增大的方向为5′→3′。重链后来亦开始复制，复制以5′→3′的方向进行。最后，两条轻链完成了复制，形成了两个新的、完全一样的DNA双螺旋环。
（4）差别DNA复制或基因扩增（gene amplification）：在真核生物的某个发育阶段中，DNA分子的某一段顺序反复进行复制，而其他部分不复制，这种现象称为基因扩增。对基因扩增现象研究得比较清楚的是两栖类卵母细胞发育中的 rRNA基因，即rDNA。
爪蟾细胞每个核平均只有两个核仁，rDNA约有800~900份。可是，当卵母细胞在成熟过程中的双线期，核仁数增加到600~1600个，含有的rDNA可达200万份。rDNA 顺序就占了卵母细胞DNA量的75%。这种基因扩增仅发生在卵母细胞中，它适应于胚胎发育中对大量核糖体的需要。当胚胎期开始时，这些染色体外的rDNA拷贝即失去功能并逐渐消失。
9．真核生物和原核生物在DNA复制上的差别
（1）复制起点数：真核生物的每条染色质上可有多处复制起点；原核生物一条DNA分子上常只有一个起始点。
（2）任一复制起点是否重复复制：真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不再开始，即在一个复制点上不能进行重复复制，但可有多个复制叉。原核生物的DNA可重复复制，一条DNA分子上仅一个复制叉。
（3）复制子的长度：真核生物的每个复制子较短，包括保守区，长约15000～90000bp。原核生物的复制子较长，大约长100000bp。
（4）复制起始时是否需原点识别物：真核生物复制起始时需原点识别复合物（ORC）参与；而原核生物则不需要，可直接启动。
（5）复制速度：真核生物复制时移动速度慢，大约复制50bp/秒；原核生物复制快，大约为1000bp/秒，为真核生物的20倍。
（6）复制机构：真核生物复制所需酶和蛋白质的种类及结构多且复杂，原核生物则较少而简单。
（7）复制的精确度：真核生物复制的精确度非常高，出错率仅为3bp/109bp；而原核生物的精确度则稍低，出错率为1/105bp。
