三、细菌接合
           Lederberg 和 E. L. Tatum（1946~1947）在E.coli K₁₂ 品系中首先发现细菌可通过暂时的沟通和染色体转移而导致基因重组，这一过程称为细菌接合（bacterial conjugation）。
    1．细菌接合实验
    有两个菌株：菌株A是甲硫氨酸（met）和生物素（bio）缺陷型；菌株B是苏氨酸（thr）、亮氨酸（leu）和硫胺（thi）营养缺陷型。它们的基因型分别为：
    菌株A：met^－ bio^－ thr leu thi
    菌楝B：met bio   thr^－ leu^－ thi^－  
    菌株A和B分别在基本培养基上都不能生长，只有在完全培养基中才能生存。在完全培养液中分别培养到10⁸ 个/ml浓度时，各取出一毫升混合接种于完全培养液中，经过几小时培养后进行离心、洗涤，将细胞涂布在固体基本培养基上，同时将菌株A和菌株B也做同样处理，作为对照。结果只有混合培养后的细菌在平板上长出了菌落，而菌株A和B的平板上没有菌落，在混合菌涂布的平板上菌落出现频率约10^-7（图7-14）。
    2．细菌接合试验的解释
    （1）两种菌株通过接合导致染色体DNA的转移和重组，出现了重组体，表现原养型。
           （2）两菌株间并没有发生接合和基因重组，原养型的出现是由于营养上互补的结果
    （3）两菌株没有接合，而是一个菌株的突变型基因发生了回复突变，如met^－→met 等。
           （4）细菌细胞没有接合，而是交换了DNA（转化因子）。
    3．细菌接合产生原养型的证实
    要证实原养型的产生必须是通过细菌细胞的接合，就必须排除其他3种解释。
    （1）“交换转化因子”原因的排除：1950年Davis利用了U型管做实验，把上述的两种菌分别培养在一个中间隔开的“U”型管的两端（图7-15）。烧结玻璃使两种细菌不能接触，可是能容许培养基以及其中的大分子物质流通。在培养过程中还可在一端不间断地压入灭菌空气，使两端的培养液能更好地流通。培养一定时间后，把两边的细菌分别取出洗涤，然后分别大量接种到基本培养基上，结果没有出现原养型菌落。这就说明如果有转化因子（DNA）从中交流，能出现原养型菌落，但在该试验中却没有进行交流。
    （2）“交换营养物质”原因的排除：营养缺陷型细菌通过培养交换营养而生长的现象，称为互养。将菌株A带上T₁^r 基因（该基因为对噬菌体T₁有抗性），菌株B带上T₁^s 基因（该基因为对噬菌体T₁敏感）。让二者大量混合接种在基本培养基上，容许两种细菌有短暂时间的接触，然后喷上噬菌体T₁，把菌株A杀死。经培养后，同样有原养型菌落。这说明并非是由于两个菌株彼此间的互养。
    （3）“回复突变”原因的排除：若是回复突变这一假设成立，在菌株A中需要两个基因（met^－ bio^－）同时发生突变，在菌株B中，需3个基因（thr^－ leu^－ thi^－）同时发生回复突变。后经试验证实，细菌的任一个基因的突变率在10^-7 以下，两个基因同时发生回复突变的频率应在10^-14 以下，而3个基因同时发生回复突变的频率应为10^-21 以下。而在Lederberg 和Tatum试验中，原养型却达到了10^-7，这显然差距较大，故可排除“回复突变”的解释。
    可见，细菌必须相互接触，基因重组，才能导致染色体DNA的转移，产生原养型。
    
    四、中断杂交作图
    1．中断杂交试验
    此方法是F. Jacob和 E. Wollman（1956）首创的。所谓中断杂交作图（interrupted mating mapping）是让带有多种野生型基因并含有str ^s 的Hfr菌株与带有缺陷型基因并含有str ^r F^－ 菌株杂交，间隔一定时间取少量样品，通过剧烈搅拌或振荡使结合中的细菌细胞相互脱离，然后再在排除亲本Hfr细胞（含有链霉素）的培养基上继续培养，分析培养基上出现的菌落，确定供体基因传递的时间和顺序，从而将细菌的基因在一条直线上绘制成连锁图。
    具体试验如下：
    Hfr  thr   leu azi ^r  ton^r lac gal str ^s
    F^－   thr^－  leu^－ azi ^s  ton ^s lac^－ gal^－str ^r
    将处于对数生长期的F^－（4×10⁸个细胞/mL）和Hfr（2×10⁷个细胞/mL）混合，在肉汤培养基中进行通气培养，每隔一定时间取样，把样品放入组织搅拌器中猛烈搅拌，使细菌接合中断。经稀释后涂布到含链霉素且不含苏氨酸和亮氨酸的选择培养基的固体平板上，使thr   leu str ^r 重组体形成菌落，然后测定每一菌落的非选择性标记基因。
    结果，混合8分钟取样时，所得到的菌落的非选择性标记基因全部和F^－ 菌株相同。混合9分钟取样时，开始出现少数叠氮化钠抗性（azi ^r）菌落，说明azi ^r基因已进入少数F^－ 菌株中。混合培养11分钟取样时，开始出现噬菌体T₁（ton）抗性的细菌；混合18分钟和24分钟，又陆续出现了乳糖发酵和半乳糖发酵型菌落，说明这3个基因（ton^r、lac 、gal ）是在11、18、24分钟时先后从Hfr菌株中转入F^－ 菌株体内的（图7-16）
    2．中断杂交作图
    从上述结果看，两个菌株混合培养的时间越长，在F^－ 菌株中出现的Hfr菌株的性状越多。一个特定的Hfr菌株和一个F^－ 菌株细胞接合时，首先在F^－ 菌株中出现的供体性状是固定不变的，而且各种性状的出现有一定的先后次序。这表明供体染色体是从某一特定位置开始逐渐转移的，这一特定位置就叫转移原点（origin）。
    现以上述杂交时各基因出现的先后次序和时间为依据，画出E.coli的几个基因的连锁图（图7-17上）。如果让Hfr ×F^－杂交继续进行，长达2小时，然后使之中断，这样发现某些F^－受体菌可转变为Hfr。换句话说，致育因子最后转移到受体，并使它们成为供体，但频率非常低，因此，F因子是线性染色体转移的最后一个单位（图7-17下）。
    
    azi  T₁            lac             gal
    ←·————————|——|———————|———————|——————
    O                9   11            18             24 
    （上）
    
    azi  T₁            lac             gal                      F因子
    ←·————————|——|———————|———————|——————…………——|——
    O                9   11            18             24                      2hr
    （下） 
    
    图 7-17     大肠杆菌的部分连锁图
     
    3．环状染色体的发现
    利用上述原理和实验方法，把多个Hfr 菌株分别与F^－ 菌株杂交，得到各自的基因转移顺序（表7-5）。从表中可看出不同的Hfr菌株，其染色体转移的起点各不相同，转移的方向也不相同。
    
    表  7-5   几个Hfr菌株的基因转移顺序
    菌 株                             基因转移顺序         
    Hfr  H          O    thr    pro    lac    pur    gal   his   gly    thi
    1          O    thr    thi     gly   his     gal   pur   lac    pro
    2          O    pro   thr     thi    gly    his   gal    pur    lac
    3          O    pur   lac     pro    thr    thi   gly    his    gal
    AB 312          O    thi    thr    pro    lac    pur   gal    his    gly
    
    表7-5中，几个Hfr菌株的基因转移顺序，初看似乎很难理解，但仔细比较其基因转移顺序，却有一个共同的地方，即各个转移基因之间的毗邻关系都相同。从各个Hfr染色体各自转移的起点和方向不同，而各转移基因之间毗邻关系都相同这一事实出发，可以推断E.coli 的染色体是一个环状的DNA分子。不同的Hfr菌株是由于F因子以不同方向在不同地点整合到环状染色体的不同位置上产生的（图7-18）。